대학원생 농도 정량을 위한 STD(standard) 검량선 그리기

안녕하세요 오늘은 실험에 사용하는 물질의 농도를 구하기 위한 기초작업인 STD (standard) 그리기를 해보겠습니다. 이것을 검량선 이라고도 하는데요. 검량선은 정량적 측정을 하기 위해서 표준액에 대한 기기의 출력 신호를 표현한 것입니다. 그래프로 나타낼 때 X축에는 표준물질의 농도를 나타내어주고 Y축에는 사용하는 기기의 출력량 (보통 흡광 값, 형광 값)을 나타내어줍니다. 보통은 농도가 커질수록 (내부에 표준물질의 양이 많을수록) 흡광 값, 형광 값이 비례적으로 커지게 됩니다. 간단히 이야기를 하면 농도가 두배가 되면 측정하는 흡광, 형광 값도 두배가 되게 됩니다. 이러한 점을 이용해서 농도를 모르는 물질의 흡광, 형광 값을 이용하여서 농도를 구하게 됩니다. 실험을 해보지 않으신 분들도 이공계면은 한 번쯤은 어디서 들어 본 것 같지 않으신가요? 대학원에서도 어떠한 물질을 정량하기 위해서 이 방법을 굉장히 자주 사용하게 됩니다. 가장 편한 방법으로는 엑셀이 있겠죠? 엑셀로 예를 들어보면서 설명을 하도록 하겠습니다. 이번 포스팅에서는 흡광 값을 이용하여서 예시를 들겠습니다. 하지만 흡광뿐 아니라 형광등 다른 기기를 이용하여도 방법은 똑같습니다!

미지시료의 농도를 구하기 전에 시료의 표준용액을 만들어 흡광값을 측정하기

미지시료에 540nm에서 흡광값을 나타내는 물질 A가 있고, 그 A의 농도를 구하기 위해서는 A의 표준용액이 필요합니다. A의 농도를 다르게 희석을 하여서 540nm에서 흡광 값을 측정합니다. (이때 오차를 줄이기 위해 2번씩 측정을 하게 됩니다.) 그리고 엑셀에 정리를 해줍니다. 

 

흡광도가 아닌 흡광값! 입니다

 

엑셀에서 평균과 표준편차 구하기

 

 

잘 보이실지 모르겠는데 기호 = 옆에 평균을 의미하는 average를 선택하여 줍니다. 인수들의 평균을 구한다고 나와있습니다. 

 

 

그리고 평균을 구하고 싶은 셀을 선택해줍니다. 저는 농도 2mg/ml 에서의 흡광 값의 평균을 구하고 싶어서 두 가지를 선택을 하였습니다. 두 값을 선택 후 엔터를 눌러주면 평균값이 나오게 됩니다. 그런데 밑의 농도에서의 흡광 평균을 구하기 위해 6번을 하고 싶지는 않겠죠? 

 

 

구한 값에서 오른쪽 아래에 마우스 커서를 가져가면 빨간 십자로 표시된것처럼 검은 십자 표시가 뜨게 됩니다. 그때, 마우스 왼쪽 버튼을 누른 채로 원하는 곳까지 밑으로 내려주면 됩니다. 

 

 

그러면 알아서 평균을 다 구하여 줍니다. 이렇게 평균을 구했으면 측정한 값들의 오차가 어느정도 나는지를 구해줍니다. 평균을 구할 때와 마찬가지로 =을 붙이고 표준편차를 나타내는 stdev를 쓴 후 흡광 값을 선택하여줍니다. 그리고 나온 값을 평균과 같이 밑으로 쭉 내려주시면 됩니다. 이제 평균과 편차는 다 구했으니 그래프를 그리러 가봅시다!

검량선 그래프 그리기

그래프를 그리기 위해서 X축이 되는 농도값들과 Y축이 되는 평균을 선택을 해줍시다. Ctrl 버튼을 누르고 마우스 왼쪽버튼을 누르면서 칸을 선택할 수 있게 됩니다. 그리고 위의 메뉴에서 '삽입' 버튼을 누른 후 나오는 그래프의 '분산형' 중에서 '직선 및 표식이 있는 분산형'을 선택만 해주면 됩니다. 

 

 

위와 같이 하신 후 클릭을 하게 되면 그래프가 나오게 됩니다. 

 

 

추세선과 R제곱값 구하기(신뢰도 확인)

이렇게 X축과 Y축의 값들이 표시가 되면서 그래프가 생겨났습니다. 이때 이 값이 비례관계가 맞는지 확인을 할 것인데요. 신뢰도 R을 구한다라고 생각을 하시면 됩니다. 그래프의 점 위에서 우클릭을 해줍니다. 

 

 

그리고 추세선 추가라고 쓰여있는 버튼을 눌러줍니다. 

 

 

빨간 네모에 있는 것처럼 '수식을 차트에 표시', 'R-제곱 값을 차트에 표시'를 클릭해준후 닫기를 누르면 그래프 위에 이차방정식과 R제곱 값이 나오게 됩니다. R 제곱이 1에 가까울수록 그래프에 나타난 식을 밑을 수 있다는 뜻입니다. 보통 R제곱 값이 0.99 이상이면 신뢰할 수 있다고 보고 이 검량선을 사용하게 됩니다. (99% 정확하다고 생각하면 쉽습니다.)

미지시료에서의 A 농도값을 검량선을 이용하여 구하기

 

 

농도를 모르는 미지시료의 흡광값의 평균을 보니 35가 나와있지요? 이를 아까 구한 추세식에서 Y값에 대입을 한 후 X의 값을 구하여 줍니다. 표와 같이 X값을 구하면 6.99가 나오게 됩니다. 그러므로 우리가 가지고 있는 미지시료에는 물질 A가 6.99mg/ml의 농도로 포함되어 있다는 것을 알 수 있습니다.

이렇게 모르는 농도값을 정량할 때 사용하는 방법을 알아보았는데요. 정말 많이 사용하게 되는데 처음에만 헷갈리지 나중에는 아무 생각도 없이 평균 구하고 추세선 구하는 자신을 발견하게 될 것이라 생각합니다. ㅎㅎ 이제 중요한 것은 R제곱 값이 0.99 이상이 나와야 하는데 안 나오게 된다면 값을 다시 구해야 해서.... 반복 실험을 하게 되는 경우도 있으니 처음에 할 때 제대로 하는 것이 좋겠죠?

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